假陰性判斷：造成假陰性結果的原因有很多，主要體現(xiàn)在FAM擴增曲線不起來，原因包括標本抑制，核酸提取失敗，基因突變以及儀器故障等。 目前國內(nèi)主流PCR試劑都不帶內(nèi)標監(jiān)控功能，用于檢測目標基因的FAM擴增曲線既用來定量又用于定性（判斷陰陽性），因此FAM擴增曲線的好壞非常關鍵。對于此類無內(nèi)標試劑，建議結合乙肝血清標志物結果（五項定量/定性結果）來判斷陰陽性，即使是FAM曲線有擴增也應該參考此結果，特別是E抗原結果。同時，對于擁有競爭性內(nèi)標監(jiān)控功能的試劑來說，可有以下四種情況發(fā)生：如FAM無擴增，內(nèi)標有擴增：結果正常，判斷該樣本為陰性結果；如FAM無擴增，內(nèi)標也無擴增：結果異常，可能原因核酸提取失敗或有抑制，一定要重復實驗；如FAM有擴增，內(nèi)標有擴增：結果正常，因為待測核酸和內(nèi)標在同一反應體系下擴增；如FAM有擴增，內(nèi)標無擴增：結果正常，強陽性樣本會抑制內(nèi)標的擴增，導致內(nèi)標結果偏弱或陰性。 假陽性判斷（如何判定）：臨床PCR檢測當中造成假陽性結果的情況比較少，原因包括試劑污染，氣溶膠污染，操作污染，擴增產(chǎn)物污染，非特異性擴增，耗材污染等，所以建議一定要做陰性對照來監(jiān)控是否存在污染。

首先簡單來說，IU/ml和copies/ml是沒有直接關系的，IU/ml是國際標準物質的表述單位，copies/ml是各檢測方法對結果的表述單位的一種，可參見李金明《實時熒光PCR技術》P177。所謂的International Unit（IU），是為了統(tǒng)一各個檢測方法而設定的單位。本身PCR檢測的拷貝數(shù)是無法絕對定量的，可以理解為，為了統(tǒng)一標準，WHO制定標準物質，賦予其IU值，發(fā)放給各個PCR試劑廠商，讓他們把各自檢測結果和標準物質比較，從而得出各自的換算系數(shù)。比如分發(fā)的是1IU的標準物質，羅氏測的是2copy，那羅氏的換算系數(shù)是2（2copies=1 IU），雅培的是20copy,那雅培的就是20（20copies=1 IU），由此可見，各個方法的轉換系數(shù)是不一樣的。其次，因為各實驗方法檢測結果的表述單位存在多樣化，如copies/ml，geq/ml等，使得檢測結果沒有可比性，因而WHO應用國際單位IU作為統(tǒng)一的表述單位，使不同實驗室、不同檢測方法得出的檢測結果的表述單位得到統(tǒng)一并具有了可比性。最后，具體每種方法的檢測結果與IU的關系，可以通過同時檢測WHO的標準物質，然后根據(jù)其與標準物質的比例關系，來找到不同檢測方法IU與copies之間的關系。

  由于傳統(tǒng)定量方法都是終點檢測，即PCR到達平臺期后進行檢測，而PCR經(jīng)過對數(shù)期擴增到達平臺期時，檢測重現(xiàn)性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復實驗，所得結果有很大差異，因此無法直接從終點產(chǎn)物推算出起始模板量。加入內(nèi)標后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。  內(nèi)標定量：若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標，則PCR反應變?yōu)殡p重PCR，他們之間存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時，這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著。但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標，也正是這個原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標，但仍然只是一種半定量的方法。  外標定量：外標法不是把標準物質加入到被測樣品中，而是與被測樣品在相同條件下進行檢測。由于在熒光定量PCR中，Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關系，因此可以利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，并且在PCR循環(huán)剛剛進入真正的指數(shù)擴增期時，Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的，因此定量的結果也會準確很多。  美國Texas大學的科研人員進行了外標法定量和內(nèi)標法定量的方法學比較，得出的結論是：內(nèi)標法作為定量或半定量的手段是不可靠的，而外標準曲線的定量方法是一種準確的、值得信賴的科學方法。【Ke LD, Chen Z, Yung WK.A reliability test of standard-based quantitative PCR: exogenous vs endogenous standards. Mol.Cell Probes,2000,14(2):127-135】

采用Levey-Jerming質控圖, 以X±2SD警告線，X±3SD為失控線。質控點落在x±3S之外時，首先采取的措施是復檢，復檢的目的主要是用于查明人為誤差，也可以查出偶然誤差，如果是偶然誤差，重測的結果應在允許范圍內(nèi)。同時還在觀察標準曲線的生成情況，擴增效率的高低，曲線梯并是否良好，曲線形態(tài)是否標準，Ct值是否有飄移，還要結合臨床標本的檢測結果，是否有高值和低值，來區(qū)分是試劑造成的失控還是操作不當、儀器故障或老化造成的失控。若臨床標本測定結果的曲線標準，測量值有高有低，同時檢測的試劑空白及陰性質控均在控，很有可能是標準品質量有問題，如降解、更換試劑型號等情況發(fā)生造成的。  對于連續(xù)7個質控點落在均值之一側，若均未超出X±3s范圍時，認為存在系統(tǒng)誤差，但檢測結果仍可發(fā)出；若連續(xù)7個質控點落在均值之一側，而且質控數(shù)據(jù)有超出X±3s范圍的趨勢時(逐漸升高或逐漸降低)，一定要聯(lián)絡儀器工程師，及時校準儀器。

（1）實驗室整體布局：根據(jù)衛(wèi)生部頒發(fā)的《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》（衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號）要求，臨床基因擴增檢驗室原則上分為四個單獨的工作區(qū)域：試劑貯存和準備區(qū)，標本制備區(qū)，擴增區(qū)，產(chǎn)物分析區(qū)，也可以將后兩個區(qū)域合為一個區(qū)，即擴增及產(chǎn)物分析區(qū)。實驗室設計時按照《辦法》規(guī)定，三個區(qū)域相互獨立，并有各自的緩沖區(qū)域。

（2）各工作區(qū)域儀器設備各工作區(qū)域的儀器設備及物品，包括椅子、辦公用品、清潔用品等均不能拿出本區(qū)域，所有可移動物品均應有本區(qū)域的標示。  

各區(qū)域應具備的設備配置為：屋頂紫外燈、近臺紫外燈、一次性手套、一次性鞋套、工作服、廢液缸、掃帚、拖把、廢紙簍、微量加樣器（覆蓋1-1000ul），經(jīng)高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾芯）、筆、紙等。各工作區(qū)域的特殊配置包括：

（1）試劑貯存和準備區(qū)：2～8℃冰箱、漩渦震蕩器、超凈工作臺。

（2）標本制備：2～8℃冰箱、-20℃冰箱、高速臺式冷凍離心機、漩渦震蕩器、金屬加熱模塊、超凈工作臺。

（3）擴增及產(chǎn)物分析區(qū)：熒光定量核酸擴增儀、電腦、打印機。

 同時：進入各工作區(qū)域必須嚴格按照單一流向，并用明顯的箭頭表示，各區(qū)域用不同的顏色以示區(qū)別。即試劑貯存和設備區(qū)（藍色）→標本制備區(qū)（白色）→擴增及產(chǎn)物分析區(qū)（粉色）。

1、儀器使用的廣泛程度  

如果不是一個新出現(xiàn)的儀器品牌，為保證所購置的儀器有充分的可靠性，臨床PCR實驗室可以從相應儀器在國內(nèi)外使用的廣泛程度來判斷。應用越是廣泛的儀器，越是經(jīng)過實踐驗證的，也就越具有可靠性。

2、儀器的檢測通量（反應孔數(shù)）  

在購買定量PCR儀的時候需要根據(jù)實驗室的要求來選擇不同通量的儀器。目前市面上的熒光定量PCR儀的檢測通量小到16多到384孔，實驗室可以根據(jù)自己的檢測項目和發(fā)展狀況，選擇合適的儀器，沒必要追求最昂貴的儀器，一般來說，96孔的通量足夠用了；如需尋找新藥靶點和疾病標記等類型的實驗，則可以考慮購買384孔的儀器。

3、儀器的通道數(shù)量  

隨著醫(yī)院開展的項目越來越多，比如基因表達，單核苷酸多態(tài)性分析、高分辨率熔解曲線等，那么單通道的儀器則無法滿足實驗室的需求了，而多通道的設計則能使其更方便地檢測多重PCR檢測及其衍生的基因表達等其他分析模式。

4、耗材的開放性  

耗材如擴增反應管的開放性可能會決定日常檢測成本的高低。作為臨床PCR實驗室，在選擇實時熒光PCR儀時，可考慮這一點。不過對于檢測HCV等RNA項目的時候，盡量使用去RNAnase酶耗材。

5、硬件設計特點  

熒光定量PCR儀主要有96孔板式和離心式等，每種設計都有它的獨到之處，但也都有無法避免的缺陷。  

96孔板的熒光定量PCR儀可以容納的樣本量大，最大可至100ul，而且無需特殊的耗材。傳統(tǒng)的96孔板儀器多采用鹵鎢燈激發(fā)、CCD檢測。其優(yōu)點在于：鹵鎢燈的光強比LED燈強，波長范圍廣，對于熒光染料的激發(fā)具有非常好的效果，性能比較穩(wěn)定，使用壽命約3000個小時左右；但CCD的檢測通常會因為每個樣品孔距光源和檢測器的光程各不相同，會產(chǎn)生邊緣效應，對結果產(chǎn)生一定的影響。為了保證精確、精準的實驗結果，這類儀器在實驗過程中通常需要配合ROX校正染料，來平衡孔間差異；離心式的儀器通常選用LED激發(fā)、PMT檢測，設計上避免了邊緣效應，同時PMT檢測對熒光信號可以放大或縮小，相對于CCD檢測更加靈活，靈敏度更高；但LED的熒光強度比較弱，波長范圍也比較窄，因此，對熒光染料的激發(fā)效果不如鹵鎢燈；

6、運行速度  

在熒光定量PCR儀的眾多技術參數(shù)中，升降溫速度也是非常重要的。更快的升降溫，可以縮短反應進行的時間，而且縮短了可能的非特異性結合和反應時間，提高PCR的特異性。但是，運行速度越快，對加熱制冷模塊的要求越高，因此，穩(wěn)定性是其存在的最大問題，如果在市面上經(jīng)過長期考證的，穩(wěn)定性好的儀器，運行速度越快，帶來的便捷越多；

7、靈活性  

在儀器基本性能得到保證的情況下，另外一方面則需要考慮儀器的靈活性，主要包括：儀器運輸?shù)撵`活性，拆卸的靈活性，軟件升級的靈活性，模塊更換的靈活性以及使用的靈活性等。

現(xiàn)在臨床PCR實驗室使用的試劑大部分都是各生產(chǎn)企業(yè)提供的商品化的試劑盒，那么試劑質量的好壞直接決定了實驗結果的好壞，而不同廠家試劑的性能、質量和價格千差萬別，如何選擇一款合適的試劑對每個PCR實驗室都至關重要，一般來說，選擇試劑主要從以下幾個方面進行評價：

1、重復性  

首先，試劑檢測結果的重復性直接展現(xiàn)了試劑的方法學及其質量的好壞，是評價試劑好壞最明顯、最直接的指標。  

其次，我們在此說的試劑重復性是指對原始樣本檢測的重復性，而不是對某一個樣本提取的核酸進行重復性的檢測和評價。  

最后，試劑的重復性對于療效檢測、用藥指導有著重大的意義，一個重復性好的試劑，往往能夠在病人的抗病毒治療過程中，給醫(yī)生和病人提供最直接、最可靠的數(shù)據(jù)，讓醫(yī)生和病人對疾病進展有更清楚的認識，從而制定合理的治療方案，實現(xiàn)更好的治療效果。

2、靈敏度  

一個試劑的靈敏度往往能夠體現(xiàn)該試劑的技術水平和先進程度，同時對于臨床病癥的監(jiān)測有著舉足輕重的意義。以乙肝為例來說，我國的乙肝復發(fā)率遠遠大于發(fā)達國家，同時由乙肝病毒感染轉換為慢性肝炎、肝硬化、肝癌的患者也居世界前列，這很大程度上與對低載量病毒監(jiān)控的嚴重不足有關。美國肝病學會專家組就提出，對乙肝抗病毒治療過程中，HBV DNA的最低監(jiān)測點應設置為10IU/ml，而歐洲和亞太肝病學也指出HBV DNA病毒載量應該盡可能小于10IU/ml。這都足以證明，高靈敏度對于用藥治療、病程監(jiān)控等起著巨大的作用，靈敏度越高，對于疾病的監(jiān)控效果更好，對于確定治療的終點，具有積極的指導作用。

3、定量準確性  

對于臨床檢測中定量項目來說，試劑盒定量的準確性是非常重要的，也是評價定量試劑盒的一個重要指標之一。衛(wèi)生部每年都會有2次全國性的室間質評，通過質評結果可以很好的看出試劑盒定量的準確性。  但往往很多時候，實驗室在選擇試劑的時候都偏重與過去的試劑盒比較定量結果的差異，并以過去的試劑盒定值作為標準來參考和評價一種新試劑，其實這種方法不完全可取。不過可以通過同時檢測衛(wèi)生部的質控品來進行比較，這樣才使得兩種試劑在同一客觀標準上進行PK，得到合理公平的評價。  

同時，要驗證一個試劑的定量是否準確，我們可以采用一個高濃度樣本，用陰性血清依次進行10倍梯度的稀釋，然后選取多家試劑公司的產(chǎn)品進行同步檢測PK，考察各公司試劑對樣本定值的實際值與理論值的差異，即可判斷各公司試劑定量準確與否。 

4、有無內(nèi)標監(jiān)測  

內(nèi)標的一個最主要的作用就是控制假陰性結果的發(fā)生，但在國內(nèi)臨床檢測中往往被忽視了，這主要與兩個方面有關，一個是之前國內(nèi)使用的很多熒光定量PCR儀均為單通道的儀器，無法進行多色熒光的檢測；國內(nèi)外PCR行業(yè)對內(nèi)標的研究已不是一個新興課題，目前國內(nèi)PCR行業(yè)能把內(nèi)標做得非常好的科研單位或商業(yè)化的PCR試劑廠家寥寥無幾，這正體現(xiàn)了這一技術的難度。  

在臨床檢測中，內(nèi)標的作用非常重要。在臨床檢測過程中，怎么做到每一個陰性結果均為真正的陰性結果，從而杜絕因擴增抑制而出現(xiàn)的假陰性結果呢？內(nèi)標的加入就能夠很好的防止假陰性結果了，加入我們做了一個樣本，它的目標檢測熒光為陰性，內(nèi)標檢測熒光也為陰性，那么這個樣本的擴增則受到了抑制，該陰性結果為假陰性，我們必須對該樣本進行復檢。如果試劑沒有內(nèi)標的話，我們則不能很好的判斷該結果是否正常？是否可以發(fā)報告？在發(fā)報告時，我們無法保證發(fā)出去的結果百分之百的準確；內(nèi)標的加入，就可以解決我們這方面的煩惱。目前，衛(wèi)生部的專家也在大力推崇內(nèi)標的重要性，也是為了保證檢驗結果的準確可靠。

5、線性定量范圍  

試劑盒的線性定量范圍指的是試劑盒最低檢測下限和最高檢測上限之間的范圍，范圍越寬說明試劑盒性能越好。

6、UNG酶防污染體系  

PCR反應過程中， 1個拷貝的DNA經(jīng)過30個循環(huán)后，可以增長到10億個拷貝的產(chǎn)物DNA， 極微量的PCR 產(chǎn)物污染，就可能造成假陽性，因而這是一個值得特別重視的問題。尿嘧啶糖苷酶（UNG）法：將PCR 產(chǎn)物中的dT用dU 代替。這種dU 化的PCR 產(chǎn)物與UNG 一起孵育，因UNG 可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可除去dU 而阻止TaqDNA 聚合酶的延伸，從而失去被再擴增的能力。UNG 對不含dU 的模板無任何影響，UNG 可從單或雙鏈DNA 中消除尿嘧啶，而對RNA 中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無任何作用。  

此外，試劑的穩(wěn)定性、批間差、溯源性（是否溯源于WHO國際標準品）等也都是考察一款試劑盒質量重要指標。

體外診斷試劑是指采用免疫學、微生物學、分子生物學等原理或方法制備的、在體外用于對人類疾病的診斷、檢測及流行病學調查等的診斷試劑，包括微生物抗原、人類基因檢測、腫瘤標記物等等。我國對體外生物診斷試劑按藥品進行管理，對體外化學及生化診斷試劑等其他類別的試劑則按醫(yī)療器械進行管理。這種分類管理的模式帶來了一些問題：按照《藥品管理法》及藥品 GMP 認證的要求，按藥品進行管理的體外診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)必須通過 GMP 認證。部分企業(yè)由于產(chǎn)值較低，企業(yè)發(fā)展規(guī)模有限，根本無力申報 GMP 認證。SFDA 醫(yī)療器械司助理巡視員常永亨介紹說，自 2005 年起， SFDA 就把體外診斷試劑監(jiān)管當作一項重點來抓，正探索全新的管理模式，已經(jīng)著手起草新的管理辦法，并在網(wǎng)上公開征求各界意見。此次邀請歐盟專家來華，也正是為了借鑒國際經(jīng)驗，做到科學監(jiān)管，促進行業(yè)健康發(fā)展。據(jù)克里斯蒂 ? 塔瑞佳介紹，美國、加拿大等國和歐盟一直都將體外診斷試劑歸入器械類管理。歐洲委員會于 1998 年 10 月 27 日 正式通過了 98/79/EC 體外診斷器械指令（簡稱 IVDD 指令），并公告于 1998 年 12 月 7 日 的第 L331 號歐盟公報上。根據(jù)公報的內(nèi)容，歐盟各成員國必須于 2000 年 6 月 7 日 之前完成執(zhí)行本指令所需要的相關法規(guī)命令修制定與公告，自 2003 年 12 月起，所有在歐盟各成員國銷售的體外診斷器械均須依照本指令完成符合性評價程序，貼上 CE 標記，才能在歐盟上市。根據(jù)歐盟的 IVDD 指令，體外診斷試劑是作為一類特殊產(chǎn)品單獨管理的，在該指令附錄 Ⅱ 中，目錄 A 和目錄 B 上的品種因風險級別較高而管理相對嚴格。除此之外，歐盟對其他大部分風險級別較低的產(chǎn)品實行自我管理，即制造商建立質量管理體系，保留技術文件，做自我保證聲明，通常無需政府批準即可上市。各國管理體外診斷試劑的具體法規(guī)雖略有不同，但大體上都是根據(jù)風險管理的原則進行的，其對高風險的認定也比較一致，因為畢竟不同于藥品和醫(yī)療器械，其主要應用于體外，大部分體外診斷試劑是一種風險程度比較低的產(chǎn)品， 80% 左右的產(chǎn)品不屬于高風險級別，因此歐盟的這種管理模式相對容易，管理成本也低。